تشخیص بیماری های ویروسی گیاهان

در تشخیص بیماری های ویروسی گیاهان روش های مختلفی مورد استفاده قرار می گیرد که بر حسب نوع بیماری و امکانات یک آزمایشگاه می توان همه یا تعدادی از این روشها را به کار بست.

اولین قدم در شناسایی یک بیماری ویروسی ، شناخت علائم بیماری ویروسی است . در مراجعه به طبیعت مثل مزرعه ، باغ ، جنگل یا گلخانه و امثال اینها بر اساس یک بیماری ویروسی نمونه های بیماری انتخاب می شوند .این علائم بسیار متعددند . بیشترین علائم شامل تغییر رنگ و تغییر شکل می باشد.تغییر رنگ مثل علائم موزاییک ، ابلقی ، زردی ، زردی رگبرگ ، لکه های حلقوی ، لکه نواری و موارد متعدد دیگر است.

پس از انتخاب گیاهان بیمار بر اساس علائم مشخص نمونه های گیاهان آلوده همراه با تعدادی از گیاهان سالم داخل پلاستیک به آزمایشگاه منتقل می شوند.اگر فاصله ی منطقه با آزمایشگاه زیاد باشدباید در محیط سرد مثل فلاسک حاوی یخ به آزمایشگاه منتقل می شود.در غیر اینصورت در بین فاصله ی انتقال ویروس غیر فعال خواهد شد.پس از انتقال ویروس به آزمایشگاه باید این نمونه برای آزمایشهای تشخیصی ویروس آماده شود.برای عصاره گیری از بافر فسفات یا بافر سیترات یا بافر بورات استفاده می کنیم.بافر Naclفسفات کاربرد بیشتری دارد اما اگر ویروس به آن حساسیت داشته باشداز بقیه استفاده می شود.بافر فسفات را با محلول 85%

استفاده می کنند.این بافر باید بعد از تهیه و آماده شدندر یخچال نگهداری شده و به صورت سرد مصرف شود که به این بافر بافر فسفات سیلین گفته می شود.

اولین کار برای عصاره گیری این است که برگ یا قسمتی از برگ که علامت تیپیک دارد یا دمبرگ برای عصاره گیری انتخاب شود.سطح برگ بصورت ملایم زیر آب  لوله کشی شسته می شود و بعد روی سطح تمیز و ضد عفونی شده نمون های برگ به وسیله ی تیغ اسکالپل استریل به قطعات کوچکتر به ابعاد حداکثر 5 میلی متر خرد می شود.قطعات خرد شده ی برگ در داخل یک هاون چینی استریل  و سرد رسخته می شود و همراه با کمی بافر فسفات سیلسن به وسیله ی دسته ی هاون ساییده می شود.قبل از این کار لازم است به اندازه ی یک نخود پودر کاربوراندوم داخل هاون ریخته شود که ظاهری شبیه خاکستردارد.عمل ساییدن نمونه های برگ داخل هاون باید به قدری ادامه یابد که یک عصاره ی سبزرنگ ، مایع نه خیلی غلیظ و نه خیلی رقیق به صورت یکدست به دست بیاید.پودر کاربوراندوم به این دلیل به عصاره اضافه می شود که در هنگام تلقیح می تواند خراش های بسیار ریز و زیاد در سطح برگ ایجاد کند .این خراش ها به نفوذ ویروس به درون بافت گیاه کمک می کند. پس از تهیه ی عصاره ی یکنواخت ویروسی آن را از یک پارچه ی ململ عبور می دهیم . پس از عبور دادن عصاره از صافی کاغذی  یا پارچه ی ململ آن را به یک گیاه محک  White Burlyتلقیح می کنیم. گیاه محک در این آزمایش می تواند توتون یا شمعدانی باشد،که در هنگام استفاده از تتون از رقم

استفاده می شود.این ها گیاهان محک هستند ، اگر به این گیاه ویروس تلقیح شود علایم بیماری شبیه علایم گیاه بیماری ایجاد می شود.علاوه برگیاه محک می توان از نمونه گیاه سالم که بیماری ازآن جدا شده است استفاده کنیم.روش تلقیح به این صورت است که ابتدا یک بوته ی سالم شمعدانی یا توتون انتخاب می شود، از گیاهی استفاده می شود که بیماری نداشته باشد.قبل از تلقیح باید دست ها را باآب و صابون یا الکل ضدعفونی کردیا از دستکش های استریل و یکبار مصرف استفاده شود ومقداری از عصاره ی تهیه شده را با انگشت روی تعدادی از برگ های توتون یا شمعدانی می مالیم.پس از مالیدن عصاره روی برگ به وسیله ی آب فشان عصاره ی اضافه ی باقی مانده در سطح برگ را شست شو می دهیم.در صورتی که شست شو  پس از تلقیح صورت نگیرد عصاره ی باقی مانده ممکن است باعث بروز علایم بیماری در برگ تلقیح شده گردد. پس از این کار روی دمبرگ برگ های تلقیح شده برچسب نصب میشود.گلدان های تلقیح شده را در شرایط مناسب گلخانه یا آزمایشگاه نگهداری می کنیم و یکروز پس از تلقیح بروز علایم در برگهای تلقیح شده را بررسی وثبت می کنیم.هرنوع تغییر رنگ برگ ها و بروز علایم یادداشت برداری می شود و به عنوان نتیجه آزمایش گزارش می شود. درصورتی که علایم مشابه در برگ های تلقیح شده مشاهده شود می توان نتیجه گرفت که بیماری یا علایم غیر عادی ایجاد شده در گیاه نتیجه ی آلودگی به ویروس است. تعیین دقیق نوع آلودگی یا نوع بیماری و نوع ویروس نیازمند انجام آزمایشات بعدی خواهد بود که با استفاده از نمونه های گیاهی و عصاره گیاه انجام می شود.این آزمایشات شامل مراحل مختلفی است:

 

 

الف) آزمون بیماری زایی روی گیاهان مختلف اعم از گیاهان میزبان و محک

ب) آزمون های تشخیص سرولوژیک

ج)استفاده از میکروسکوپ الکترونی

د)استفاده از روش های مولکولی

طرز تهیه ی بافر فسفات

Na2HPO4 و KH2PO4برای تهیه ی بافر فسفات که در عصاره گیری مورد استفاده قرار میگیرد از دو ماده استفاده می شود . یکی

برای تهیه ی این بافر محلول ذخیره راتهیه می کنیم . به این دلیل تهیه می شود که بتوانیم برای استفاده از بافر آن را همیشه به صورت تازه با استفاده از محلول ذخیره  به صورت تازه دز اختیار داشته باشیم .مونو پتاسیم فسفات 15/1 ممولار تهیه می شود به این صورت که 08/9 گرم مونو پتاسیم فسفات در یک  لیتر آب مقطر از دی سدیم فسفات 15/1 مولار استفاده می کنیم استفاده می  و ... می توان استفاده کرد.NaH2 ,Na, کنیم.به جای مواد بالا می توانیم از

در یک لیتر آب مقطر می ریزیم.بعد از تهیه ی این محلول ها  به نسبتی که مشخص شده مخلوط می کنیم و Na2HPO48/11 گرم

بافر فسفات به دست می آید.

X mL A + (100-x) mL B

ایکس با توجه به اینکه بافر از چه  نوعی باشد تغییر مکند.

PH=5  => X= 98.8

PH=6 => X=78.8

PH=7 => X=39.7

PH=7 => X=36.2

بافر فسفات = 39.2 mL A + (100-39.2) mL B

65.53 گرم در 0.2 A تهیه می شود . هر دو 0.2 مولار هستند . از ماده A=Nahpo4,B= NaH2PO4 بافر فسفات با استفاده از

های مختلف با هم با هم قابل اختلاطPHمولار اسفاده می شود و از ماده ی دوم 31.2  گرم . این دو ماده بانسبت های مختلفی در

مقدار ماده ی اول  مقدار ماده ی اول 305 سی سی و ماده ی دوم  198 سی سی.pH=7است تا فسفات بافر به دست آید. برای

بافر مناسب تهیه PH مقدار ماده ی اول 473.5 و مقدار ماده ی دوم 265 سی سی است . به این ترتیب بر اساس نوع بافر و PH=8

می شود .

 

 

 

تشخیص ویروس های گیاهی

روش های سرولوژیک

ویروس به عنوان پاتوژن و جسم خارجی وقتی که وارد بدن یک حیوان خونگرم میشود به عنوان یک آنتی ژن داخل سیستم گردش خون حیوان باعث تحریک واکنش ایمنی حیوان می شود . این واکنش منجر به تولید آنتی بادی در داخل سیستم گردش خون میزبان می شود .آنتی بادی تولید شده از نظر ساختمانی با آنتی ژنی که علیه آن در داخل خون حیوان تولید شده مرتبط است.به این معنی که آنتی بادی تولید شده می تواند آنتی ژن خود را دریک محیط مناسب شناسایی کند و با آن اتصال ایجاد کند ، مثل قفل و کلید آنتی ژن با آنتی بادی چفت می شود. از این خصوصیت برای شناخت ویروس به عنوان آنتی ژن استفاده می شود . عصاره ی خالص شده ی ویروس را ابتدا به روش صحیح تهیه می کنیم و می توان این عصاره را در حجم های مناسب نگهداری کرد. لازم است که به این عصاره  یک نوع عصاره به نام ادجونت کامل اضافه شود که به این منظور به به آنتی ژن اضافه می شود تا هنگام تزریق آنتی ژن را به صورت تدریجی در بدن حیوان آزاد کند و در نتیجه باعث عدم بروز واکنش های شوک آمیز و مرگ آور در حیوان است . اگر آنتی ژن یکباره وارد خون حیوان شود در مواردی باعث مرگ حیوان می شود. حیوانی که برای تزریق انتخاب می شود موش یا خرگوش است که اغلب از خرگوش نیوزلندی استفاده می کنند . حیوانات دیگری هم بسته به نوع آزمایش اسنفاده می شوند مثل خوکچه هندی و بز و اسب و جوجه و ...

بهتر است که تزریق اول عضلانی باشد ، برای تزریق وریدی استفاده از ادجونت توصیه نمی شود  و معممولا چون تزریق عضلانی صورت می گیرد وجود ادجونت باعث آزاد شدن تدریجی آنتی ژن و ورود تدریجی آن به خون می شود و در نتیجه باعث بروز واکنش ایمنی در بدن حیوان و تولید آنتی بادی در سرم خون حیوان خواهد بود . تزریق حداقل 4 و حداکثر 7 بار صورت می گیرد و فواصل تزریق یک هفته است. پس از آخرین تزریق و قبل از خون گیری کامل از حیوان باید از وجود غلظت مناسب آنتی بادی که علیه آنتی ژن در خون تولید شده اطمینان حاصل شود و برای این منظور باید عیار سنجی آنتی بادی صورت گیرد. برای عیار سنجی ابتدا حجم کمی از خون حیوان گرفته می شود . سرم خون از گلبول ها جدا شده و این سرم ، آنتی سرم نامیده می شود چون حاوی آنتی بادی است . پس از اینکه سرم خون به صورت خالص تهیه شد رقت های مختلفی از آن تهیه شده وبا رقت های مختلفی از آنتی ژن در داخل لوله های آزمایش ترکیب و داخل حمام بن ماری حرارت داده شده و پیدایش رسوب داخل لوله ها .

کمی یا زیادی رسوب تولید شده در لوله ها عیار آنتی بادی را مشخص خواهد کرد. پس از این آزمایش  واثبات عیار آنتی بادی در خون بر اساس میزان رسوب تولید شده در مورد خون گیری کامل از حیوان یا ادامه ی تزریق آنتی ژن تمصیم گیری می شود . یعنی اگر نتیجه ی آمایش کمبود آنتی بادی باشد باید تزریق ادامه یابد و در غیر اینصورت خونگیری کامل از حیوان صورت می گیرد.

در روش دیگر با سرنگ های بزرگ وخونگیری از قلب خرگوش این کار را انجام می دهند .پس از خونگیری کامل سرم خون از بقیه ی قسمت ها طی چند مرحله جدا می شود.در اولین مرحله نمونه ی خون چند ساعت در یک ظرف نگه داشته می شود تا گلبولها از سرم جدا شوند ، پس از حذف گلبولها سرم باقی مانده را در چند نوبت سانتریفیوژمی کنیم تا سایر گلبول ها هم جدا شوند . آنچه در آخر سانتریفیوژ باقی می ماند آنتی سرم است . این سرم را می توانیم به حجم های کوچک تقسیم کرده  و در دماهای زیر صفرنگهداری کنیم.آنتی بادی تهیه شده برای شناسایی ویرس در چند آزمایش می تواند مورد استفاده قرار بگیرد.تستهایی که در سرولوژیک برای شناسایی ویروس ها مورد استفاده قرار میگیرد به این ترتیب است :

1.آزمایش نشت دو طرفه  در آگار یا آزمایش اخترلونی

Double Gel Diffusion Test

این آزمایش برای شناسایی ویروس ها و باکتری های بیماری زا است.در این آزمایش واکنش متقابل ویروس به عنوان آنتی ژن و آنتی بادی در داخل ژل به صورت خطوط سفید رسوبی ظاهر می شود که شکل خطوط  تشکیل شده بیانگر نوع ارتباط بین ویروس و آنتی بادی تهیه شده خواهد بود .

روش کار: ابتدا پتری دیش های شیشه ای استریل یا پلاستیکی یکبار مصرف تهیه می شود و لایه ی نازکی از ژل آگار که داخل اتوکلاو استریل شده است به ضخامت حداکثر 5 میلی متر در داخل پتری با ریختن آگار ایجاد می شود .این لایه پس از سرد شدن آگار به صورت منجمد درآمده و در مرحله ی بعد لایه ی بعدی از ژل آگارز که در داخل اتوکلاو استریل شده است روی آن ریخته می شود و ضخامت این ژل هم 5 میلی متر است . آگارز ، آگار کاملا خالص است . پس از جامد شدن لایه ی آگارز در داخل ژل با  ایجاد سوراخ هایی ، چاهک ها ایجاد می شود که شامل یک چاهک در وسط و چند چاهک در اطراف است > قطر چاهک ها 5 میلی متر است  .فاصله ی بین چاهک های وسطی و کناری حداکثر 1 سانی متر است . هرچه  چاهک ها با دقت بیشتری تهیه شود دقت آزمایش بالاتر خواهد بود.پس از ایجاد مجموعه ی چاهک ها ، آنتی ژن وآنتی بادی تهیه شده داخل چاهک به وسیله ی میکروپیپت یا سمپلر ریخته می شود . معمولا به دلیل اینکه حجم آنتی بادی کم است در چاهک وسط و آنتی ژن در چاهک کناری ،  Ab، آنتی بادی =Agریخته کی شود. آنتی ژن=

آنتی ژن های مختلف عصاره ی ویروس از نمونه های مختلف است.مثلا از 6 بوته ی مختلف توتون که علایم موزاییک داشته اند نمونه برداری کرده وعصاره گیری کرده ایم. به این دلیل جدا کرده ایم که واکنش های مختلفی بین آنتی ژن و آنتی بادی ها انجام شود و ایجاد نسل های جدید شود.

پس از ریختن این دو در چاک ها سطح آنها را با پارافین پوشانده و با گذاشتن در پتری و نگهداری درآزمایشگاه نتایج را حداقل پس از 5 روز ثبت کنیم.نتیجه ی این آزمایش بر اساس ایجاد خطوط رسوبی بین چاهک های وسطی و کناری و بر اساس شکل خطوط رسوبی قابل تفسیر و ارزیابی است . در صورتی که آنتی ژن در هر 6 مورد یکسان باشد و باآنتی بادی کامل مرتبط ابشد در اینصورت خطوط رسوبی ایجاد شده  بین آنتی ژن ها و آنتی بادی ها  به صورت زیر خواهد بود اگر این خطوط به هم متصل شود نشان دهنده ی این است که همه ی آنتی ژن ها از یک نوع اند . وجود خطوط بیانگر ارتباط آنتی ژن وآنتی بادی است.

 

در شناخت ویروس های گیاهی که قبلا شناسایی شده اند لازم است که از آنتی بادی های مرجع یا استاندارد استفاده شود ، یکی از روش ها این است ک خودمان آنتی بادی تولید کنیم.

ELIZA                                                                                                2. آزمایش الیزا

این آزمون یک آزمون سرولوژیک است که از دقت بالایی برخوردار است و نایج آن به سرعت در آزمایشگاه مشخص می شود و ازاین روش در تشخیص ویروس های گیاهی و باکتری و قارچ و نماتود مورد استفاده قرار می گیرد .

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

اساس این آزمایش ارتباط بین آنتی ژن و آنتی بادی است اما این ارتباط به صورت مستقیم در این آزمایش برقرار نمی شود بلکه ارتباط غیر مستقیمی که بین آنتی ژن و آنتی بادی ایجاد می گردد و بر بروز واکنش هایی درون چاهک منجر می گردد در این آزمایش نتیجه ی مثبت را نشان خواهد داد و در غیر اینصورت نتیجه منفی خواهد بود.

روش کار: مثل بقیه ی روش های سرولوژیک ، اولین مرحله تهیه  ی آنتی ژن است .

1 آنتی ژن باید خالص باشد.

2 تهیه ی آنتی بادی

3 تهیه ی آنتی بادی متصل به آنزیم ( یکی از بهترین آنزیم ها ، آنزیم آلکالین فسفاتاز است)

4 تهیه ی سوبسترای آنزیم ( هر آنزیمی روی یک ماده ی زمینه اثر می کند که سوبسترا نامیده می شود) سوبسترایی که بیشتر استفاده می شود پارانیتروفیل فسفات است.

5 تهیه ی پلیت های الیزا. جنسشان از ماده ای به نام پلی استایرن است . نوع جنس چاهک ها  سبب می شود که هم آنتی ژن و هم   میگویند.conjugate آنتی بادی به دیواره ی چاهک بچسبد و جدا نشود. اصطلاحا آنتی بادی متصل به آنزیم را

ابتدا به وسیله ی سمپلر به داخل چاهک ها آنتی بادی ریخته می شود که در منابع آنتی بادی را با واژه ی گاماگلوبولین می شناسیم که  است.Gمشهورترین آن گاماگلوبولین

1 پس ازریختن آنتی بادی در چاهک های پلیت چاهک ها با بافر فسفات شسته می شود

2 شست و شو با بافر فسفات .

3 ریختن آنتی ن به چاهک ها .

4 شست و شوی چاهک ها با ابفر به منظور حذف آنتی ژن های اضافی از داخل چاهک ها .

5 ریختن آنتی بادی متصل هبآنزیم به چاهک ها .

6 شست وشوی چاهک ها با ابفر.

7 افزودن سوبسترا به چاهک ها .

8 شست وشوی چاهک ها با بافر .

9 مشاهده ی تغییر یا عدم تغییر رنگ در چاهک ها .

اگر ویروس با آنتی بادی مرتبط باشد  قطعا تغییر رنگ  در چاهک ها دیده خواهد شد  و زرد خواهد بود که رنگ ماه ی حاصل از تجزیه ی سوبسترا به وسیله ی آنزیم آرکالین فسفاتاز است . عدم مشاهده ی رنگ زرد نشانه ی عدم ارتباط بین آنتی بادی و آنتی ژن است .و این روش ،  روش ساندویچی دو طرفه گفته می شود.

نتیجه این است که در کمترین  زمان اب دقت بالا ویروس هایی را که به صورت عصاره ی خالص تهیه کرده ایم شناسایی کنیم ، در  اضافه می کنند.NaoHحد جنس و گونه . برای اینکه داخل چاهک ها تجزیه ی سوبسترا مداوم باشد به داخل چاهک ها

تا هیدرولیز سوبسترا به وسیله ی آنزیم متوقف شود و اندازه گیری رنگ داخل چاهک ها به صورت چشمی یا دستگاه الیزا ریدر انجام شد.

یک گرم آگار در 100 سی سی  بافر فسفات حل می کنیم. میتوان به جای بافر فسفات از آب مقطر هم استفاده کرد . این مخلوط را می جوشانیم و سپس به این مخلوط  0.02 گرم سدیم آزید اضافه می کنیم . این مخلوط راسپس داخل پتری دیش ها ریخته و در مواردی با استفاده از پیپت مقداری از آگار ذوب شده را روی لام ریخته به نحوی که از کناره های لام سرریز نکند(حدود 7 سی سی) . بعد از اینکه ژل روی لام یا داخل پتری دیش منجمد شد با استفاده از چوب پنبه سوراخ کن استریل مطابق یک طرح آماده شده روی کاغذ سوراخ هایی را روی ژل ایجاد می کنیم . این سوراخ ها قطرشان 5 میلی متر و نسبت به چاهک وسطی 5 سانتی متر باید فاصله داشته باشد. بعداز سوراخ کردن با مکش قطعات بریده شده را تخلیه می کنیم تا چاهک هایی در محل بریده شده ایجاد گردد. اگر از پتری دیش های شیشه ای استفاده کنیم ، استفاده از لایه ی آگار زیری قبل از  لایه ی آگارز ضروری است.اما در مورد پتری های پلاستیکی ضرورتی برای ریختن لایه ی زیرین آگار نیست. حفره هایی که داخل آگار یا آگارز ایجاد می شود به این دلیل که اگر مدت طولانی به این حالت بماند داخل آنها مایع جمع می شود که در آزمایش ایجاد مشکل می کند.

 

 

نحوه ی تهیه ی آنتی ژن و آنتی بادی

قبل از ریختن آنتی بادی باید آن را با بافر فسفات سیلین رقیق کنیم

Naclبافر فسفات سیلین= بافر فسفات + %0.85

بعد از رقیق سازی ، آنتی ژن و آنتی بادی را به وسیله ی سمپلر یا میکروپیپت درون چاهک ها می ریزیم. آزمون باید در شرایط مرطوب انجام شود، چون اگر شرایط خشک باشد به دلیل حجم کم نمونه ها به سرعت تبخیر شده و نتیجه ی آزمایش غلط خواهد بود . پس بهتر است سطح آگار را با روغن معدنی با پارافین مایع بپوشانیم، سپس پتری دیش را در آزمایشگاه به صورت دربسته و به مدت یک هفته و دمای 20 درجه ی سانتی گراد نگهداری کنیم. پس از یک هفته خطوط سفید رسوبی بین چاهک وسط و چاهک های کناری ایجاد می شود . شکل این رسوب می تواند در تعیین نتایج آزمایش کمک کند .  ممعولا خطوط رسوبی بین 24-48 ساعت ظاهر می شوند  و گاهی بین 1-2 هفته پتری دیش را در دمای 20 درجه سانتی گراد نگهداری میکنیم.

حالت هایی که در آزمایش نشت آگار ایجاد می شود:

Agآنتی ژن =

Ab آنتی بادی=

خط رسوبی که با فاصله ی یکسان از آنتی ژن و آنتی بادی ایجاد می شود زمانی به وجود می آید که که آنتی بادی حاوی قسمت هایی باشد  یا آنتی سرم مجموعه ای از آنتی بادی هایی باشد که که در واکنش به نوعی منشا غیر ویروسی تشکیل شده . پروتئین منشا گیاهی دارد و عصاره ی ویروسی خالصی نبوده . سرعت نشت چنین آنتی بادی که مربوط به پروتئین گیاهی است مثل سرعت نشت مولکول های آنتی بادی است .

آنتی ژن یا آنتی ویروس خیلی کندتر از آنتی بادی رسوب کرده

 

 

ذرات ویروس سرعت نشت بیشتری دارند نسبت به آنتی بادی

 

 

احتمالا دو جزء  در حفره ی آنتی ژن وجود دارد که در حفره ی آنتی بادی ، آنتی بادی های مربوط به آن وجود دارند. مثلا در حفره ی آنتی ژن هم ویروس  وهم پروتئین گیاهی است، حالتی مشابه هم وجود دارد که خطوط رسوبی غیر واضح تشکیل شده  و نتیجه ای است که بین آنتی ژن وآنتی بادی یک واکنش صورت گرفته و مقدار واکنش دهنده ها اوپتیمم نبوده و مقدار آنتی بادی زیاد تر بوده است.

 

تفسیر نتیجه ی آزمون بیان کننده ی ارتباط بین ویروس ها یا نژاد های ویروس خواهد بود:

واکنش بین این دو به این صورت خواهد بود که دو خط رسوبی متقاطع تشکیل خواهد شد، در اینجا آنی ژن ها تعیین کنندده ی آنتی ژنی مشابه ندارند. خط رسوبی متقاطع بین آنتی بادی و دو چاهک آنتی ژن ایجاد شده نشان  دهنده ی عدم  ارتباط دو آنتی ژن 1 و 2 است ، هرچ ند آنتی بادی های این ها به صورت مخلوط درون آنتی سرم وجود دارند یا به عبارتی زمانی چنین خط رسوبی ایجاد می شود که  در دو حفره ی آنتی ژن دو وروس متفاوت وجود داشته باشد.

 

 

در صورتی که درون چاهک های آنتی ژن دو آنتی ژن مشابه و یکسان وجود داشته باشد و آنت بادی نیز با این دو آنتی ژن مرتبط باشد این نوع واکنش رسوبی بروز کرده  و انتهای خطوط رسوبی در مرز بین دو چاهک آنتی ژن به هم متصل شده و همدیگر راقطع نمی کنند ، نشان دهنده ی این است که یا دو ویروس یکی هستند یا بسیار شبیه هم اند.

 

تفسیر این نوع واکنش این است که  اگر ویروس ها در تعدادی از تعیین کننده های آنتی ژنی مشترک باشند چنین واکنشی بروز میکند ، در این صورت هلال رسوب آنتی بادی های اختصاصی با آنتی ژن همگن به خارج از هلال رسوب آنتی ژن غیر همگن نشت می کند . این حالت نشان می هد که ویروس ها به هم نزدیک اند و یک رابطه ی نسبی بین آنها وجود دراد اما شباهت کامل ندارند. مثلا در مورد نژادهای نزدیک  ویروس یا آنتی سرمی که در مقابل یکی از ویروس ها تهیه شده در محل برخورد هلال دو رسوب شاخکی تشکیل می شود.

 

جداسازی و کشت باکتری های بیماری زای گیاهی

ازپاتوژن های مهم گیاهی اند و در گیاهان ایجاد سوختگی و پژمردگی و و پوسیدگی و شانکر و گال می کند که در تعدای از گیاهان بیماتری های مهمی تلقی می سود  مثلا بیماری سوختگی آتشی در سیب وگلابی، شانکر باکتریایی در مرکبات ، گال باکتریایی در انگور و تعدادی از میزبان های دو لپه ای ، پوسیدگی قهوه ای سیب زمینی ، پوسیدگی حلقه ای سیب زمینی.

برای جداسازی و کشت یک باکتری بیماریزا باید نمونه های بیماری بر اساس علائم مشخص بیماری شناسایی و جمع آوری شود و نمونه هادر کیسه های پلاستیک به آزمایگاه منتقل می شود، در صورتی که فاصله ی بین محل نمونه برداری و آزمایشگاه زیاد باشد باید نونه را در محیط سرد یا فلاسک حاوی یخ به آزمایشگاه منتقل کرد . در آزمایشگاه باید تا زمان جداسازی باکتری باید نمونه در یخچال نگهداری شود.برای تست اولیه ی نمونه ها می توان ابتدا قسمتی از بافت گیاه  را در داخل یک یا چند قطره آب مقطر و یا ماده ی رنگی قرار دهیم  و زیر میکروسکوپ مشاهده کنیم ، در صورت وججود آلودگی باکتریایی جریان ملایمی به صورت شفاف  باکتری نامیده می شود. این تست ابتدا Ooze از داخل گیاه خارج شده و این جریان حاوی تعدادی از سلول باکتری می باشد که

می تواند نشان دهد که در نمونه های گیاهی باکتری حضور دارد اما اثبات دقیق این موضوع نیازمند کشت نمونه و جداسازی باکتری از نونه هاستو بعد از انجام تست باکتری باید از بافت گیاهی استخراج و خالص شود ، برای این منظور نمونه ی آلوده زیر جریان ملایم آب لوله کشی شست و شو شده سپس در روی یک سطح ضد عفونی شده آنرا به قطعات کوچکی توسط تیغ اسکالپل  استریل برش می دهیم. بهتر است در قطعات برش داده شده  هم بافت سالن و هم آلوده ی گیاه وجود داشته باشد. قطعات برش دار شده داخل آب مقطر استریل درون پتری دیش استریل  به مدت 1-2 ساعت قرار داده می شود. پتری دیش ها باید در بسته باشند . پس از این مدت با استفاده از چند قطره از آب مقطر درون پتری در روی محیط کشت نوترینت آگار ، آگار را کشت می دهیم : ابتدا چند قطره از آب مقطر حاوی باکتری را در روی محیط کشت می گذاریم و به وسیله ی لوپ استریل چند قطره آب مقطر روی محیط کشت پخش می کنیم. سپس لوپ را روی شعله ی چراغ الکلی استریل کرده  و بعداز سرد کردن از انتهای خط 1 چند خط به وسیله ی لوپ استریل روی محیط کشت می کشیم ( خط2) ، مجددا لوپ استریل و سرد می شود و از انتهای خط2 چند خط مجددا کشیده می شود ( خط3) . دوباره لوپ را استریل کرده و سرد می کنیم و از انتهای خط 3 دو باره چند خط می کشیم ( خط 4) . انتهای خط 1و 4 نباید به هم متصل شوند. بعداز این مراحل پتری دیش را به صورت دربسته در دمای حدود 20 درجه سانتی گراد در انکوباتور قرار می دهیم. بعد از 3-4 روز باکتری در محیط کشت رشد می کند . ظهور باکتری در محیط کشت به صورت کلنی های لعابی به رنگ های مختلف سفید و شیری و زرد و قرمز و به اشکال مختلف گردو سیال  با حاشیه ی صاف یا ناصاف به صورت تخت یا محدب ممکن است بروز کند. کلنی باکتری در خط اول کاملا متراکم  و غیر واضح و آمیخته  با باکتری های دیگر است ، اما در خط 4 تک کلنی

 

Streakهای باکتری به صورت کاملا جدا می شود این نوع کشت دادن رامخطط کردن  میگویند .

تهیه ی محیط کشت نوترینت آگار برای جداسازی و کشت باکتری های بیماری زای گیاهی

این محیط کشت هم می تواند به صورت آماده باشد ویا از مخلوطی از مواد مختلف تهیه شود. آگار غذایی بر اساس برچسبی که روی محسط کشت نوشته شده تهیه می شود. مقدار مورد نیاز 10 گرم/500سی سی ، است. محیط کشت تهیه شده را دوباره گرم می کنیم مثلا در اتوکلاو در دمای 100 درجه ی سانتی گراد قرار می دهیم، به مدت 10 دقیقه صبر می کننیم تا دمای 50 درجه سرد شود و بعد محیط کشت را می ریزیم.( چون از آنتی بادی استفاده نمی شود ).

بعد از تهیه ی محیط کشت باید از باید از کشت های مجدد استفاده شود، برای اینکه محیط کشت سالم داشته باشیم این کار را انجام می دهیم..در روش کشت مجدد کشت خالص باکتری باید تازه و آماده برای استفاده درتست های تشخیصی باشد.تست تازه تستی است که حدود 24 ساعت از کت آن گذشته باشد.در این نوع کشت باکتری در فاز رشد لگاریتمی استو سلول های جوان محیط گشت را تشکیل می دهد، مزیت آن این است  که در آزمون های تشخیص بیوشیمیایی فیزیولوژیک جواب صحیح مطلوب خواهد شد . استفاده از محیط کشت کهنه در آزمونها نتایج غلط یا مغشوشی را حاصل می کند.کشت مجدد مشابه کشتهای قبلی به صورت مخطط خواهد بودو بعداز کشت محیط های کشت در دمای مناسب اتاق یا انکوباتور به مدت 2-3 روز نگهداری می شود، البته می توان این کشت هارا به یخچال منتقل کرد و مدت طولانی تری از آن استفاده کرد. از معایب مهم کشت مجدد این است که باکتری ممکن است قدرت بیماری زایی خود را از دست بدهد یا قدرت بیماری زایی باکتری تا حد زیادی کاهش می یابد.پس توصیه می شود که برای آزمون های بیماری زایی وتست های فوق حساسیت در توتون از کشت هایی استفاده شود که مربوط به کشت های مجدد نباشد. برای شناساییی باکتری جداسازی شده وخالص باید در مورد بیماری زایی آن در گیاه اطمینان حاصل شود . برای اطمینان از بیماری زا بودن باکتری:

تلقیح باکتری خالص و تازه به گیاه مشابه  کن باید به روش مناسبی صورت گیرد تا تیجه ی مطلوب در خصوص ایجاد علائم در گیاهان تلقیح شده انجام شود.

ممکن است تلقیح باکتری به صورت اسپری یا تزریق یا مالیدن باکتری به یک سطح زخمی از اندام گیاهی باشد و ...

آزمون فوق حساسیت در توتون یاشمعدانی

استفاده می شود و در گلدان ها کاشته شده و تلقیح انجام می شود، بهWhite Burlyذر این آزمون ترجیحا از توتون و واریته ی

جای توتون می توان از شمعدانی استفاده کرد که می تواند واکنش فوق حساسیت در اثر تزریق باکتری نشان می هد . چه در آزمون بیماری زایی و چه در فوق حساسیت لازم است که ابتدا کشت 24 ساعته ی باکتری در محیط کشت نوترینت آگار تهیه شود. این کشت به وشیله ی آب مقطر استرسل به صورت سوسپانسیون تهیه می شود که سوسپانسیون تهیه شده باید برای تزریق تا رقت معینی آماده  باشد در این صورت واکنش فوق حساسیت در توتون یا cfuشود، ثابت شده است که اگر جمعیت ابکتری داخل سوسپانسیون 109

شمعدانی  ایجاد می شود  ، واحد تشکیل دهنده ی کلنی اگر این مقدار باشد جمعبتش برای ایجاد واکنش فوق حساسیت کفایت می کند . برای تنظیم این مقدار جمعیت باید این سوسپانسیون کدورت سنی شود که با دستگاه اسپکتروفوتومتر انجام می شود. ابتدا این دستگاه را تنظیم یا کالیبره می کنیم که ا استفاده از یک بافر آب مقطر انجام می شود

جذب نور = Absorbance = A

OD=  Optical Density

=عبور نور.T= Transsmitance

برای آب مقطر میزان عبور نور صفر است . در مقابل واحد دیگری در دستگاه قابل تنظیم است یعنی  عبور نور.

مقدار جذب نور 100 خواهد بود. به معمول در مورد سوسپانسیون باکتری از دو واحد اولی استفاده می شود. طول موجی ک هدستگاه در آن تنظیم می شود 600 نانومتر است و دستگاه کالیبره شده و سوسپانسیون باکتری داخل ظروف دستگاه اسپکتروفوتومتر کدورت سنجی می شود که به شکل مثلث است که کوت یا سل نامیده می شود. برای اینکه عدد      Tکه در صورت تنظیم شدن روی

بین 0.1-0.2 خوانده شود . اگر اعداد نشان داده شده بیشتر از اینOD 109 بدست آید و سوسپانسین برای تزریق مناسب باشد  باید

مقدار باشد یعنی سوسپانسیون غلیظ است و با افزودن آب مقطر متوان آنرا رقیق کردتا به مقدار تنظیمی دستگاه اسپکتروفوتومتر برسیم  و به وسیله ی سرنگ استریل سوسپانسیون را به بشره ی زیرین برگ توتون یا شمعدانی تزریق می کنیم  و روی دمبرگ برگ های تزریقی برچسب زده و چند تزریق هم با آب مقطر استریل به عنوان شاهد انجام می دهیم.گلدان های تزریق شده را در شرایط گلخانه نگهداری می کنیم  و از 5-6 ساعت بعد از تزریق تا حدود 72 ساعت  هرنوع تغییر رنگ در برگ هی تزریق شده را ثبت و یادداشت می نیم. اگر باکتری بیماری زای گیاهی باشد در برگ ها ابتدا علائم کلروز یا زردی ظاهر مش یود و بعد این لکه ها تبدیل به لکه های بافت مرده می شود  اگر چنین علائمی در مدت حداکثر 72 ساعت در برگای تزریقی مشاهده نشد ، باکتری بیماری زای گیاهی نیست.

آزمون گرم

بعد ا زاثبات بیماری زا بودن باکتری جداسازی شده از گیاه آلوده یا بیمار باید تست های تشخیصی باکتری به منظور تعیین جنس ، گونه و زیر گونه ی باکتری انجام گیرد.از اولین تست هایی که باید انجام شود  آزمون گرم است که به وسیله ی آقای گرم ابداء شده ، این آزمون رب اساس رنگ آمیزی سلول باکتری در سه مرحله انجام می شود که در پایان رنگ آمیزی  باکتری هایی که به رنگ آمیزی واکنش مثبت نشان داده اند  به عنوان گرم مثبت فرض شده و به رنگ آبی تیره یا بنفش دیده می شود  باکتری هایی که واکنش منفی نشان می دهند گرم منفی  هستند و به رنگ قرمز دیده می شوند.

مواد مورد نیاز : 1 . کشت خالص  24 ساعته ی باکتری ، 2 . لام تمیز ، 3 . الکل، 4 . آب مقطر ، 5 . چراغ الکلی ، 6 . ظرف مناسب برای شست و شو ی لام  رنگ آمیزی شده ، 7 . مواد رنگی به ترتیب شامل کریستال ویوله ، لوگول ، سافرانین اُ

البته در مورد سوم می توان الکل یا استون یا مخلوط 50:50 از این دو استفاده کرد.

ابتدا لام تکیزی انتخاب و مقداری از کلنی تازه ی باکتری در یک طرف لام به وسیله ی لوپ استریل قرار داده می شود و سپس به وسیله ی یک لام دیگر کلنی باکتری به آرامی توسط یک قشر نازک در سطح لام پخش می شود . قشر باکتری پخش شده نباید نه خیلی نه خیلی نازک و نه خیلی ضخیم باشد در  غیر این صورت شاید نتیجه ی  رنگ آمیزی درست نباشد . قشر پخش شده ی  باکتری را به آرامی از روی شعله ی چراغ الکلی عبور دهیم  تا کاملا روی لام تثبیت شود ، سپس لام را روی یک سطح صاف به صورت افقی قرار می دهیم . ابتدا محلول رنگی کریستال ویوله را به طور کامل روی سطح لام  می ریزیم طوری که تمام سطح لام به وسیله ی محلول رنگی کریستال ویوله پوشانده شود . بعد از یک دقیقه رنگ را از روی لام خالی می کنیم ، سطح لام را به وسیله ی آب مقطر به مدت چند ثانیه شست و شو می دهیم ، سپس سطح لام را به آرامی به وسیله ی کاغذ صافی یا خشک کن ، خشک می کنیم . در مرحله ی بعد ریختن محلول رنگی  لوگول روی لام ، این مرحله ی رنگ آمیزی نیز یک دقیقه خواهد بود . لوگول عبارتست از محلول الکلی ید در یدور پتاسیم که باید در یک شیشه ی تیره رنگ نگهداری شود و بعد از یک دقیقه رنگ را از روی لام خالی کرده و به وسیله آب مقطر  سطح لام را شسته و با کاغذ صافی خشک کنیم. مرحله  ی بعد رنگ بری به وسیله ی الکل اتیلیک خالص ( 96%) ویا به وسیله ی استون خواهد بود  این مرحله در صورتی که با الکل انجام شود حدود 30 ثانیه طول می کشد که بعد از آن الکل را از روی لا م خالی و سطح لام را به وسیله ی را کاغذ خشک کن ، خشک می کنیم و بعد سطح لام را با آب مقطر به مدت چند ثانیه شست و شو می دهیم .آخرین مرحله ی رنگ آمیزی سطح لام به وسیله ی محلول رنگی سافرانین به مدت 10 ثانیه است  که پس  از آن رنگ  را از روی  لا م خالی کرده و با آب مقطر به مدت چند ساعت شست و شو و با کاغذ صافی سطح لام را خشک می کنیم ، لام زیر میکروسکوپ مشاهده می شود ، اگر رنگ لام آبی تیره یا بنفش باشد  باکتری گرم مثبت است و اگر به رنگ قرمز باشد گرم منفی است

 

آزمون حلالیت در پتاس3%

آزمایشی سریع برای ثابت کردن گرم مثبت یا منفی بودن باکتری است

، لام تمیز KOH 3% مواد :

با قطره چکان می ریزیم و مقدار کمی از کلنی باکتری را با لوپ استریل  یا KOH 3%روش کار: ابتدا  روی لام تمیز 1-2 قطره   روی لام به طور کامل مخلوط میکنیم  و تولید یا عدم تولید ماده ی چسبناک و قابل کش آمدن KOHچوب کبریت برداشته و با محلول با برداشتن  چوب کبریت از سطح لام قابل تشخیص خواهد بود . اگر کش بیاید گرم منفی است و اگر کش نیاید  گرم مثبت است .

 

Oxidative Fermentative                                   OFآزمون

میخ خواهیم ثابت کنیم که باکتری هوازی اجباری است یا اختیاری  یا اینکه بی هوازی است .

، قند گلوکز، پارافین مایع ، لوله ی آزمایشOFمواد لازم : محیط کشت

خنثی به رنگ سبز دیده می شود که PHابتدا محیط کشت  را به اندازه ی مورد نیاز تهیه و استریل می کنیم . این محیط کشت در

معرف برم تیمول بلو است .

خنثی PHرنگ سبز=>

قلیاییPH رنگ آبی =>

اسیدیPH  رنگ زرد=>

همزمان محلول گلوکز10% تهیه و با استفاده از فیلتراسیون استریل می شود مه قطر آن ها بین 0.45-0.1 میکرومتر است . ارلن را در اتو کلاو استریل می کنیم و سپس کاغذ فیلتر را روی سطح ظرف می گذاریم  و ظرف دیگر را در سرش قرار داده و با گیره  مخلوط می کنیم . قبل از ریختن محیط کشتOFمحکم می کنیم  و بعد محلول قندی را میریزیم  که آن را با محیط کشت استریل شده ی آنرا با محلول قندی استریل شده مخلوط میکنیم و در لوله های آزمایش با حجم ثابت می ریزیم . در صورتی که  فیلتر نداشته باشیم از روش تیندالیزاسیون  استفاده می کنیم  که عبارتست از جوشاندن محلول به مدت 20 دقیقه  ر 3 روز متوالی به مدت 24 ساعت . با این روش محلول قندی تجزیه هم نمی شود . در آخر تلقیح کلنی باکتری در دو لوله ی آزمایش حاوی محیط کشت صورت می گیرد . پس از تلقیح باکتری در محیط کشت روی یکی از آن ها  به ارتفاع 2 سانتی متر پارافین مایع استریل می ریزیم  و روی دیگری ریخته نمی شود . ریختن پارافین مایع  به منظور تامین شرایط بی هوازی بدن پارافین خواهد بود . لوله های آزمایش پس از تلقیح در شرایط آزمایشگاه  یا انکوباتور به مدت 1 هفته تا 1 ماه نگهداری می شود پس از این مدت ثبت نتیجه آزمایش بر اساس تغییر رنگ از سبز به زرد  در لوله های آزمایش پارافین دار وبدون پارافین صورت می گیرد. اگر پارافین زرد شده باشد  نشان دهنده این است که باکتری بی  هوازی اجباری است ، چون  در شرایط هوازی هیچ رشدی  نکرده امادر زیر پارافین رشد کرده  نشانه ی رشد باکتری  وتکثیر آن ، تغییر رنگ است .

دلیل ترشح اسید دز محیط کشت زنده بودن باکتری در محیط کشت  و تکثیر  باکتری و استفاده از قند محیط کشت است . اگر فقط لوله ی آزمایش بدون پارافین زرد شده باشد  و لوله ی آزمایش پارافین دار بدون تغییر باشد نشانه ی هوازی بودن است  و اگر هر دو لوله ی آزمایش پارافین رشد کرده باشد نشانه ی بی هوازی بودن باکتری اختیاری است.

 

Levant test   or   Levan formation    تست  لوان

لوان یک پلی ساکارید برون سلولی است که توسط تعدادی باکتری تولید می شود  و وجود یا عدم وجود این خصوصیت ، خصوصیاتی را به اکتری می بخشد  که می تواند به حفاظت آنها در محیط های خشک و بی آب  کمک کند . باکتری هایی که لوان تولید می کنند با استفاده از آنزیم لوان سوکراز  این ماده را ساکارز سولید می کنند.

روش کار: محیط کشت نوترینت آگار به اندازه ی مورد نیاز تهیه شده  و 5% ساکارز اضافه می شود ، سپس این محیط کشت در اتوکلاو استریل و بعد در پتری دیش های استریل پخش می شود . پس از انجناد و سرد شدن محیط کشت بامتری یا باکتری های مورد نظر به صورت خطی یا لکه ای در محیط کشت تلقیح می شود . محیط کشت های تلقیح شده را درشرایط آزممایشگاه  و دمای 20-25 درجه یا در انکوباتور نگهداری می کنیم. ثبت نتیجه آزمایش بعد از حداقل 3 روز صورت می کیرد  در صورتی که کلنی های لعاب دار یا گنبدی شکل تشکیل شود  باکتری لوان مثبت  در غیر این صورت لوان  منفی است.

 

Starch hydrolysis   آزمایش هیدرولیز نشاسته

به منظور شناسایی باکتری هاست . نشاسته از دو پلی ساکارید تشکیل شده : آمسلوز وآمیلو پکتین . از نظر مقدار درصد مقدار آمیلو پکتین بیشتر است . توانایی یک باکتری برای اینکه بتواند نشاسته را هیدرولیز کند  و گلوکز را به وجود آورد وابسته به وجود یا عدم وجود تعدادی از آنزیم هاست  که می تواند هیدرولیز کامل نشاسته را تا تولید گلوکز انجام می دهد.  باکتری هایی نیز هستند که قادر به هیدولیز کامل نشاسته نیستند ، چون  آنزیم های لازم برای هیدرولیز را ندارند  از جکله آنزیم های آلفا آمبلاز و مالتاز. در اثر هیدرولیز نشاسته به وسیله ی آنزیم آلفا آمیلاز محصولات واسطه ای در محیط تولید می شود  که متفاوتند مثل اولین محصولی که از تجزیه ی نشاسته حاصل می شود که آمیلوز + آمیلو پکتین است. آمیلوز و آمیلوپکتین  شاید با تاثیر بیشتر آلفا آمیلاز تجزیه شود .

آمیلو پکتین بر اثر آنزیم آلفا آمیلاز => دکسترین براثر آنزیم آلفا آمیلاز => آکرودکسترین  بر اثر آنزیم آلفا آمیلاز => اولیگو 1 و 6 گلوکوزیداز=> آلفا-مالتوز بر اثر آنزیم مالتاز => دو مولکول گلوکز  که در حضور لوگول بی رنگ است .

روش کار: تهیه ی محیط کشت نوترینت آگار ، اضافه کردن نشاسته ی محلول به اندازه ی دو در هزار.سپس محیط کشت استریل و در پتری دیش های استریل پخش می شود و پس از انجماد محیط کشت کلنی های باکتری های تازه ی مورد نظر را به صورت خطی یا لکه ای در محیط کشت تلقیح می کنیم . سپس آنها را در دمای آزمایشگاه ویا انکوباتور به مدت 3 روز نگه می داریم. ارزیابی نتیجه ی آزمایش بعداز 3 روز با ریختن محلول لوگول روی محیط کشت انجام می شود. اگر رنگ محیط کشت آبی شود نتیجه ی آزمایش منفی است و اگر بی رنگ یا شفاف باشد  نتیجه مثبت است.

آزمایش  DNase

دی اکسی ریبو نوکلئاز

DNA هستند می تواند DNase انجام می شود. باکتری هایی که دارای آنزیم DNAبه منظور اثبات توانایی باکتری در تجزیه ی

موجود در محیط کشت خود را به نوکلئوتیدهای تشکیل دهنده ی آن تجزیه کنند.

روش کار: ابتدا محیط کشت را به اندازه ی مورد نیاز تهیه ، پس از استریل کردن دراتوکلاو و در پتری دیش های استریل ریخته  می شود  بعد از سرد ومنجمد شدن محیط کشت ، باکتری های مورد نظر را به صورت لکه ای یا خطی در محیط کشت تلقیح می کنیم  و آن هارا در آزمایشگاه در دمای 20-25 درجه سانتی گراد  یا در انکوباتور نگهداری می کنیم . ثبت نتیجه آزمایش بعد از 3 روز انجام می شود. برای ثبت نتیجه آزمایش روی محیط کشت اسید کلریدریک 3 نرمال می ریزیم ، در صورتی که  در اطراف  مثبت و در غیر این صورت منفی است.DNase کلنی باکتری  هاله ی شفاف ایجاد شود  باکتری

در حضور اسید کلریدریک رسوب  DNA در اسید کلریدریک  محلول اند در صورتی که خود DNA تفسیر نتیجه : نوکلئوتیدهای

کرده و حل نمی شود .پس بامتری اگر دی-ان-ای موجود در محیط کشت را تجزیه کند نوکلئوتیدهای حاصل از تجزیه در اسید کلریدریک حل شده و اطراف ملنی باکتری شفاف می شود  اما اگر دی-ان-ای تجزیه نشده باشد دی-ان-ای در اسید کلریدریک رسوب کرده و هاله ی شفاف در اطراف کلنی باکتری ایجاد نمی شود.

آزمون تولید پیگمان فلورسنت

در مورد جنس پزدوموناس انجام می گیدر و توانایی تولید رنگ فلورسنت یا رنگدانه ی فلورسنت توسط باکتری مورد آزمایش قرار می گیرد . تولید رنگدانه ی فلورسنت که با نام فلورسین شناخته می شود از ویژگی های باکتری پزودوموناس است. در این آزمایش   به اندازه ی مورد نیاز تهیه و به ازای مقدار تهیه شده گلیسیرین نیز به آن اضافه شده و سپس King ,s B Medium ابتدا محیط کشت اتوکلاو می گردد . پس از استریل کردن محیط کشت در پتری دیش های استریل می ریزیم. بعد از انجماد محیط کشت تلقیح باکتری به صورت لکه ای یا خظی انجام می شود. ثبت نتیجه ی آزمایش بعد از 3-4 روز بر اساس تولید یا عدم تولید پیگمان زرد مایل به سبز در محیط کشت انجام می گیرد . این پیگمان در درون محیط کشت نیز نفوذ کرده و از پشت پتری دیش مشخص است . در صورت تولید پیگمان با قرار دادن پتری دیش زیر لامپ ماوراء بنفش در محیط کشت درخشندگی ایجاد می شود.

آزمایش ذوب ژلاتین

برای اثبات توانایی یک باکتری در ذوب ژلاتین انجام می گیرد ، باکتری هایی که دارای توانایی ذوب ژلاتین اند آنزیم مربوطه به نام آنزیم ژلاتیناز را دارند. باکتری هایی که قادر به تجزیه ی ژلاتین نیستند ، فاقد ژلاتیناز اند. ژلاتین پروتئینی است که از منشا آن کلاژن و  کلاژن هم از بافت پیوندیمنشا می گیرد. کلاژن یک پروتئین نامحلول است اما بعد از جوشاند ن به ژلاتین که محلول است تبدیل مشود . از نظر ساختمان شیمیایی هر دو مشابه اند و ساختمان فیزیکی متفاوت است . در نتیجه ی ذوب ژلاتین خاصیت چسبندگی و ژله ای را از دست دادهع  و به مایع تبدیل می شود و حتی در یخچال هم حالت مایع حفظ می شود. باکتری به این دلیل ژلاتین را تجزیه می کند، چون مولکول ژلاتین بزرگ است و برای مصرف ژلاتین باید آن را به واحدهای کوچکتر تبدیل کند.

روش کار:  نوترینت ژلاتین به مقدار کافی تهیه می شود ، محیط کشت تهیه شده روی اجاق برقی یا گاز تا دمای 50 درجه گرم می شود، چون ژلاتین در آب سرد حل می شود تا محیط کشت کاملا در آب مقطر حل شود .پس از حل شدن محیط کشت آن را در لوله ی آزمایش یا حجم 5 سی سی تقسیم می کنیم. لوله ی آزمایش حاوی محیط کشت را به صورت دربسته در در اتوکلاو استریل می کنیم، سپس باکتری مورد نظر را به محیط کشت تلقیح می کنیم و سپس لوله ای آزمایش را در در دمای آزمایشگاه  یا در انکوباتور 20-25 درجه به مدت 3-4 روز نگهداری می کنیم. قبل از ثبت نتیجه ی آزمایش لازم است لوله های آزمایش 1 ساعت در یخچال نگهداری شود .بعد ثبت نتیجه بر اساس سیال بودن یا جامد بودن محیط کشت در لوله های آزمایش به عنوان به ترتیب نتیجه ی مثبت ( ژلاتیناز مثبت) و نتیجه ی منفی ( ژلاتیناز منفی)  انجام می دهیم.قرار دادن لوله های آزمایش در یخچال قبل از ثبت نتیجه  به منظور حف دمای محیط در ذوب کردن ژلاتین است.

آزمون لهانیدن ورقه های سیب زمینی

توانایی باکتری برای تجزیه ی بافت های سیب زمینی ارزیابی می شود ، در واقع در این آزمایش فعالیت آنزیم پروتوپپتیناز ارزیابی می شود .

روش کار: ابتدا یک غده ی سیب زمینی کاملا شست وشو می شود سپس سطح آن را با الکل ضد عفونی کرده و با تیغ اسکالپل استریل پوست آن را کنده و ورقه های نازک  به ضخامت 1 سانتی متر  از آن تهیه می شود. در هنگام تهیه ی ورقه ها باید مراقب بود که ورقه ها روی میز کار نیفتد.سپس ورقه ها را باید در پتری دیش استریل قرار داد ، سپس در روی ورقه ی سیب زمینی  یک شیار باریک به ضخامت 2-3 میلی متر به وسیله ی تیغ اسکالپل ایجاد می شود. سپس مقداری از کلنی تازه ی باکتری را روی این شیار داخل سیب زمینی  میمالیم ، کمی آب مقطر استریل داخل پتری دیش میریزیم طوری که سطح آب بالاتر از سیب زمینی قرار نگیرد. پتری دیش را به صورت در بسته در شرایط آزمایشگاه به مدت 4-5 روز نگهداری میکنیم . بعد ارزیبی نتیجه ی آزمایش بر اساس ایجاد لهیدگی و بد بو یا عدم تغییر در سیب زمینی به ترتیب به عنوان نتایج مثبت یا منفی ثبت می شود.

از سیستئین و تیوسولفات سدیم H2Sآزمون تولید

برای اثبات توانایی باکتری برای تولید گاز هیدروژن سولفید به صورت آنزیمی از مواد آلی گوگرد دار انجام می شود از جمله اسیدآمینه ی سیستئین  یا سیستئین یا تیوسولفات سدیم. برخی منابع مثل پپتون ، سیستئین و سیستئین یا تیوسولفات سدیم به عنوان منبع گوگرد مور استفاده ی باکتری قرار می گیرد اما لازم است آنزیم مربوط به تجزیه  این مواد یعنی آنزیم سیستئیناز یا آنزیم سیستئین   ، اسید پیروویک و آمونیاک است.H2Sسولفید را  داشته باشد . نتیجه ی تاثیر این آنزیم  بر روی این مواد تولید

این گاز ، بی رنگ است  ، متصاعد شدن آن در محیط کشت تا حدودی غیر محسوس است . اما همین گاز می تواند  با استات سرب  واکنش داده و ترکیب  ین دو سولفید سرب + استات می دهد. سولفید سرب سیاهرنگ است .

0.5 گرمK2HPO4روش کار: ابتدا محیط کشت مایع  وای-اس-بروس تهیه می شود که ترکیباتش شامل فسفات آمونیوم 0.5 گرم ،

، سولفات منیزیم 0.2 گرم ، نمک طعام 5 گرم ، عصاره ی مخمر 5 گرم و آب مقطر 100 سی سی.

به این محیط کشت 0.1 گرم سیستئین یا 0.5  گرم پپتون یا 0.5 گرم تیوسولفات سدیم  اضافه می کنیم  سپس لوله های آزمایش حاوی محیط کشت را در اتوکلاو استریل کرده و سپس باکتری مورد نظر را به لوله های آزمایش تلقیح کرده   و نوارهای کاغذی آغشته به استات سرب را در داخل لوله ی آزمایش قرار می دهیم طوری که انتهای نوارها با محیط تماس پیدا نکند . سپس لوله های آزمایش در محیط آزمایشگاه یا در انکوباتور به مدت 3-4 روز نگهداری میشود.ارزیابی نتیجه ی آزمایش بر اساس سیاه شده یا عدم تغییر رنگ نوارهای کاغذی به ترتیب به عنوان نتیجه ی مثبت یا نتیجه ی منفی ثبت می شود. اگر باکتری آنزیم سیستئیناز داشته باشد باعث خروج گاز می شود.

آزمون کاتالاز

به منظور اثبات توانایی باکتری در تولید آنزیم کاتالاز انجام می شود . این آنزیم در اغلب باکتری های هوازی و غیر هوازی تخمیری که دارای سیتوکروم هستند وجود دارد. اغلب باکتری هایی که سیستم سیتوکروم ندارند ، این آنزیم را هم ندارندو قادر به شکست آب اکسیژنه نیستند. اغلب باکتری های غیر هوازی از آنزیم پراکسیداز استفاده می کنند .کاتالازها هم در تعدادی از حیوانات و تعدادی از باکتری ها و هم گیاهان وجود دارد. کاتالازی که آب اکسیژنه را تجزیه می کند به شرایط غیر طبیعی حساس است. آب اکسیژنه یک محصول نهایی تجزیه ی هوازی قند هاست  که در صورت تجمع برای باکتری سمی استو باعث مرگش می شود ولی اگر باکتری کاتالاز داشته باشد آن را تجزیه کرده و آب اکسیژنه از تجزیه ی آن حاصل می شود.

روش کار: ابتدا مقدار کمی از کلنی تازه ی باکتری را روی لام تمیز قرار می دهیم و سپس یک قطره آب اکسیژنه ی 3% روی آن می ریزیم ، در صورت تولید حباب هوا باکتری کاتالاز مثبتو در غیر این صورت کاتالز منفی است.

آزمون فوق حساسیت در توتون یا شمعدانی

این آزمون به منظور اثبات بیماری زی بودن باکتری است . قبل از تست باید بیماری زا بودن باکتر ی ثابت شود.

روش کار: سوسپانسیونی از کشت تازه ی باکتری به وسیله ی آب مقطر استریل تهیه می شود و سپس این سوسپانسیون را در اسپکتروفوتومتر  کدورت سنجی مشود به این معنی که با انجام کدورت سنجی  در این دستگاه باید رقت سوسپانسیون در حدی تنظیم  باشد. CFUشود که میزان جمعیت باکتری  109

برای تعیین این مقدار جمعیت در سوسپانسیون  ابتدا دستگاه روی طول موج 600 نانومتر تنظیم شده و دستگاه با استفاده از آب مقطر کالیبره می شود. اینت دستگاه هم میزا ن جذب نور  و هم عبور نور را در طول موج تنظیم شده نشان می دهد.

اگر با آب مقطر کالیبره شود جذب نور صفر و عبور نور 100 است .

سوسپانسیو باکتری پس از کالیبره شدن دستگاه داخل کوت قرار گرفته  و سپس کوت  را در داخل محفظه ی مخصوص قرار داده ،  باید مساوی با 0.1-0.2 باشد. اگر جذب نور حداکثر 0.2 باشد جمعیت باکتری ODعدد

خواهد بود .اگر غلیظ تر بود با اضافه کردن  آبب مقطر  استریل به این عدد می رسیم.پس از این تنظیم سوسپانسیون CFU 109

باکتری را با سرنگ معمولی  استریل به بشره ی زیرین برگ شمعدانی یا توتون تزریق کرده و روی دمبرگ برچسب می زنیم ، به عنوان شاهد یک یا دو تزریق هم با آب مقطر انجام می دهیم. گلدان های تلقیح شده در شرایط آزمایشگاه یا گلخانه نگهداری می شود. بروز واکنش فوق حساسیت  5-6 ساعت بعد از تزریق بررسی می شود. این واکنش شاید تا 72 ساعت در گیاه ظاهر شود. واکنش به صورت لکه های زرد در محل تزریق شروع شده و بعد تبدیل به لکه های نکروز یا بافت مرده می گردد. در صورتی که چنین واکنشی ظاهر نشود ، باکتری بیماری زای گیاهی نیست.

 

آزمون آنتی بیوگرام

در این آزمون حساسیت یا عدم حساسیت  یک باکتری نسبت به آنتی بیوتیک های مختلف مورد ارزیابی است، که به روش های مختلفی روی باکتری تاثیر می گذارد.بضی آنتی بیوتیک ها مانع تشکیل دیواره  ی سلولی  یا لایه ی پپتیدوگلیکان می شوند . مثلا پنی سیلین ، آمپی سیلین ، کاربنی سیلین ، سفالوتین،وانکومایسین،سفالکسین، . این آنتی بیوتیک ها  از سنتز دیواره ی سلولی جلوگیری می کنند. بعضی آنتی بیوتیک ها مانع از سنتز پروتئین باکتری می شوند: نئومایسین ،دوکسی سایکلین،آمیکاسین،کانامایسن،توبرامایسی،استرپتومایسین،اریتروماین،تتراسایکلین و جنتا مایسین.

باکتری جلوگیری می کنند مثل کلرامفنیکل که ایجاد تداخل در سنتز دی-ان-ای میکند.DNAبعضی آنتی بیوتیک ها از سنتز

آنتی بیوتیک هایی هستند که از سنتز اسید نوکلویک جلوگیری می کنند مثل نالدیسیک اسید.

روش کار: تهیه ی محیط کشت نوترینت آگار +2% گلوکز، سپس باکتری مورد نظر همراه با چند قطره آب مقطر استریل وری محیط کشت به وسیله ی لوپ پخش می شود. سپس دیسک های مختتلف آنتی بیوتیک با فواصل مناسب  روی محیط کشت قرار داده می شود. بعد از قرار دادن دیسک ها پتری دیش ها  در انکوباتور در دمای 20 درجه به مدت 2-3 روز نگهداری می شود ، سپس ارزیابی نتیجه ی آزمایش بر اساس رشد یا عدم رشد باکتری در اطراف دیسک های آنتی بیوتیک صورت می گیرد. اگر شعاع حلقه ی بازداری از رشد در اطراف دیسک آنتی بیوتیک بزرگ باشد ، باکتری نسبت به آنتی بیوتیک خیلی حساس است ، اگر شعاع کوچک باشد باکتری نسبت به آنتی بیوتیک حساسیت کمی دارد و اگر شعاع یا حلقه ی بازداری تشکیل نشود  و حتی در کنار دیسک کلنی باکتری  رشد نکند ، باکتری نسبت به آنتی بیوتیک حساس است.

+ نوشته شده توسط avaa در یکشنبه بیست و سوم تیر ۱۳۹۲ و ساعت 15:1 |


Powered By
BLOGFA.COM